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一、保留值與分離度重現(xiàn)性不好原因分析
問題 | 原因 | 表現(xiàn) |
不同色譜柱間差異使用期間柱變化 | 填料、鍵合相不同 柱床破壞 鍵合相丟失 硅膠基質(zhì)溶解 強(qiáng)保留組分堆積堵塞 | 保留因子(k), 分離因子(a） 柱效(N） 保留因子(k), 分離因子(a） 柱效(N) 保留因子(k), 柱效(N) |
柱外效應(yīng) | 系統(tǒng)差異、進(jìn)樣量大、進(jìn)樣閥與色譜柱之間、色譜柱與檢測(cè)器之間的管路太長(zhǎng)、檢測(cè)器流通池體積大、接頭死體積大等。 | 柱效(N) |
分離效果變差 | 流動(dòng)相組分改變 流速改變 溫度改變 | 保留因子(k)，柱效變化很小 保留因子(k), 分離因子(a) 保留因子(k), 柱效變化很小 |
柱平衡慢 | 重新平衡時(shí)間不夠 | 保留因子(k), 柱效變化很小 |
柱超載 | 樣品量太大 | 保留因子(k), 柱效(N) |
二、造成色譜峰（ 不對(duì)稱）拖尾的原因
1．色譜柱本身填裝問題,篩板堵塞或填料塌陷；
2．柱頭有污染；
3．樣品超載；
4．樣品溶劑不合適；
5．柱外效應(yīng)；
6．化學(xué)或二次保留（硅羥基）效應(yīng)；
7． 緩沖容量不足或不合適；
8． 重金屬污染。
三、如何解決峰形拖尾的問題
A. 與化學(xué)有關(guān)的拖尾問題
1．流動(dòng)相中，加入30mM的三乙胺（用于堿性化合物）或醋酸胺（用于酸性化合物）， 未知化合物加醋酸三乙胺；
2．如仍然拖尾，將三乙胺換為二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；
3.降低進(jìn)樣量至<1μg。
B. 與色譜柱有關(guān)的拖尾問題
1.如柱頭處有強(qiáng)保留的樣品組分積聚，反相柱可用20倍柱體積的96%的二氯甲烷與4%甲醇，加1%氫氧化銨混合液沖洗；正向柱可用甲醇沖洗；
2.使用保護(hù)柱。
C. 與HPLC系統(tǒng)有關(guān)的峰拖尾和峰加寬
1.進(jìn)樣體積過大，（通?！?/SPAN>25μL）；
2.進(jìn)樣閥與色譜柱及檢測(cè)器之間的管路體積過大（*連接管應(yīng)<20cm，內(nèi)徑為0.007"）；
3.檢測(cè)器流通池的體積過大。
四、如何貯存色譜柱
1.防止緩沖溶液和水溶液流動(dòng)相產(chǎn)生微生物,做到流動(dòng)相用多少配多少, 或在水流動(dòng)相中加200ppm的疊氮鈉以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)（一定當(dāng)心其毒性和潛在的爆炸性）；或在流動(dòng)相中加20%的有機(jī)改性劑，也可抑制微生物生長(zhǎng)， 有機(jī)改性劑還有助于流動(dòng)相脫氣。
2.盡可能將色譜柱貯存于100%有機(jī)溶劑（乙晴）中，避免在緩沖溶液中保存。
3.使用緩沖溶液后的色譜柱，應(yīng)用15～20倍柱體積的不含緩沖劑的同種水-有機(jī)溶劑流動(dòng)相沖洗色譜柱，后換成100%有機(jī)溶劑貯存。
4.避免用純水沖洗鍵合致密的C18柱。
5.將色譜柱的兩端用堵頭擰好，以免柱床填料干裂。
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