產(chǎn)品列表PRODUCTS LIST
反相色譜是迄今在液相色譜中應(yīng)用zui廣泛的技術(shù)，主要是因?yàn)樗m用于分析極大多數(shù)的非極性物質(zhì)和很多的可離子化的及離子化合物。大多數(shù)用于反相色譜的固定相都是天然的疏水物質(zhì)，因此，分析物是按照它們與固定相的疏水相互作用的大小來(lái)分離的，含有疏水的機(jī)制也能以同樣的保留方式分離。
固定相上還有少數(shù)物質(zhì)，如混合相（例如苯基－己基）、末端封閉和非末端封閉種類(lèi)和極性嵌入相－也存在于這些鍵合硅膠上。還有很多填料用于反相色譜，包括聚合物，聚合物表面涂上硅膠和氧化鋁，無(wú)機(jī)－有機(jī)混合物，涂層氧化鋯，和石墨化碳。不同種類(lèi)的固定相有他們自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。
反相色譜柱利用各種流動(dòng)相和添加物可以有很多的應(yīng)用。一些技術(shù)利用添加物可以改變或修飾填料的表面。有時(shí)候這些添加物有可能會(huì)污染鍵合相表面。
硅膠表面因?yàn)橛兄杷I合相而有一些別的化學(xué)性質(zhì)。殘留的硅烷醇存在于所有的硅膠鍵合填料中。這些硅烷醇具有弱酸性，因此能與某些待分析物合基質(zhì)成分，特別是堿性成分。因?yàn)楣柰榇嫉?pKa 值大約是 4.5 ，離子化能在中性 pH 條件下發(fā)生因此與陽(yáng)離子產(chǎn)生靜電相互作用就有可能發(fā)生。較老的 A 型硅膠能容納高濃度金屬離子（有時(shí)候 100ppm 或更多），而這能使硅膠表面的酸性更大甚至能發(fā)生金屬鰲合現(xiàn)象或清除一些化合物。殘留硅烷醇在非末端封閉的硅膠合短鏈鍵合相如 C2 或 C4 上更讓人煩惱。
使用者必須清楚他們所用的固定相表面特殊性質(zhì)和可能的分析物－固定相表面的相互作用，這樣當(dāng)他們使用反相方法時(shí)才能考慮到可能的基質(zhì)相互作用。例如，非常疏水的樣品基質(zhì)如玉米油，高芳香物質(zhì)，和蠟?zāi)苷匙」潭ㄏ嘌b填表面并且改變他們的性質(zhì)。含有蛋白質(zhì)物質(zhì)的生物流體也能吸附在裝填表面。盡管分析者想盡zui大努力來(lái)保護(hù) HPLC 柱子，某些分析物－基質(zhì)污染能使固定相受到有害的影響。
當(dāng)柱子被污染，它的色譜行為和沒(méi)被污染的柱子會(huì)有些不同。被污染的柱子能產(chǎn)生反壓?jiǎn)栴}。 被污染的反相柱子必須清洗和再生才能恢復(fù)原來(lái)的操作條件。這部分的 " 柱子觀察 " 將討論可行的方法使柱子回復(fù)原來(lái)的或差不多原來(lái)的狀態(tài)。因?yàn)殒I合硅膠柱子是的，我重點(diǎn)講述這種柱子。zui后，我將討論別的反相柱子的清潔步驟。
什么導(dǎo)致反相柱子污染產(chǎn)生？通常，樣品中含有一些對(duì)分析者來(lái)說(shuō)不感興趣的東西。鹽、脂質(zhì)、含脂物質(zhì)、腐質(zhì)酸、疏水蛋白質(zhì)和其它一些生物物質(zhì)是一些可能在使用時(shí)與 HPLC 柱發(fā)生相互作用的物質(zhì)。這些物質(zhì)有比分析者的目標(biāo)物或少或大的保留值。那些保留值較小的物質(zhì)如鹽類(lèi)一般來(lái)說(shuō)在空體積時(shí)就被沖出色譜柱。這些非目標(biāo)產(chǎn)物的干擾能被檢測(cè)器檢測(cè)到而且能形成色譜峰，氣泡，基線上移或者是負(fù)峰。如果樣品成分在柱子中有很強(qiáng)的保留而且流動(dòng)相溶液成分不足以把這些物質(zhì)洗脫下來(lái)，多次上樣后，這些吸附在柱子表面的物質(zhì)通常就會(huì)積累在柱頭。這些行為通常只有通過(guò)平行實(shí)驗(yàn)才能發(fā)現(xiàn)。有著中等保留值的樣品能被緩慢洗出而且表現(xiàn)為寬峰，基線擾動(dòng)，或者基線漂移。
有時(shí)候這些被吸附的樣品成分累積到一定程度足以使他們開(kāi)始形成新的固定相。分析物能與這些雜質(zhì)作用形成一定的分離機(jī)理。保留時(shí)間會(huì)波動(dòng)，拖尾會(huì)出現(xiàn)。如果足夠的污染產(chǎn)生，柱子的反壓能超過(guò)泵所能承受的zui大壓力，使柱子無(wú)法工作以及在堵塞處產(chǎn)生空體積。
清洗硅膠鍵合柱子
再生被污染 HPLC 柱子的關(guān)鍵是知道污染物的性質(zhì)并且能找到適當(dāng)?shù)娜軇﹣?lái)去除。如果污染是因?yàn)橹貜?fù)進(jìn)樣時(shí)強(qiáng)保留物質(zhì)的累積引起的，利用簡(jiǎn)單的步驟來(lái)除去這些污染物往往能恢復(fù)其色譜行為。有時(shí)候，經(jīng)過(guò)多次操作以后的色譜柱用 90 ～ 100 ％的溶劑 B （雙溶劑反相系統(tǒng)中較強(qiáng)的溶劑）沖洗 20 個(gè)體積可以清除污染物。（表 2 列舉了不同規(guī)格的 HPLC 柱子的空體積，因此讀者能方便地確定相應(yīng)柱子沖洗的體積。）例如，柱子中殘留的脂質(zhì)就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、四氫呋喃。如果你使用的是緩沖液系統(tǒng)，不要直接切換到強(qiáng)溶劑，突然轉(zhuǎn)換到高濃度有機(jī)溶劑可能會(huì)使 HPLC 流動(dòng)體系中的緩沖液沉淀，這樣會(huì)導(dǎo)致更大的問(wèn)題如柱頭堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)軸失靈。應(yīng)該先用無(wú)緩沖流動(dòng)相（即把緩沖液換成水）。沖洗 5 ～ 10 個(gè)體積以后才更換強(qiáng)溶劑。
有時(shí)候，強(qiáng)溶劑也沒(méi)法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么更強(qiáng)的溶劑或者是一系列溶劑就有必要用來(lái)清洗柱子樂(lè)，如果污染物是非生物物質(zhì)，使用者可以跳過(guò)一個(gè)或多個(gè)另外的有機(jī)溶劑去除污染物。溶劑與溶劑之間的組合有很多。到柱子廠家的網(wǎng)頁(yè)上能找到推薦的溶劑系統(tǒng)。
一般來(lái)說(shuō)，所有的清洗方法都有類(lèi)似的形式。所用的溶劑都是隨溶劑強(qiáng)度增加，經(jīng)常zui后一個(gè)溶劑是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烴），可以用來(lái)溶解非極性物質(zhì)如脂質(zhì)和油類(lèi)。我們必須保證一系列溶劑中每個(gè)溶劑都能與下一個(gè)溶劑互混。清洗過(guò)程要結(jié)束時(shí)，必須借助一個(gè)中等強(qiáng)度能互混的溶劑而回到原始溶劑系統(tǒng)。例如，異丙醇是一個(gè)非常好的作為中間步驟的溶劑，因?yàn)樗芘c正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過(guò)高。當(dāng)然，如果使用紫外檢測(cè)器的話，避免溶劑在紫外區(qū)域有吸收，要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。
對(duì)于典型的硅膠鍵合柱來(lái)說(shuō)如果沒(méi)有緩沖溶液的話推薦使用以下溶劑系列：
100 ％甲醇
100 ％乙晴
75 ％乙晴－ 25 ％異丙醇
100 ％異丙醇
100 ％二氯甲烷
100 ％正己烷
用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶劑相容性柱子必須用異丙醇沖洗后才能用原來(lái)的水相溶劑。每種溶劑至少?zèng)_洗 10 個(gè)柱體積。如 250mm × 4.6mmHPLC 分析柱，分析者可以用 1 ～ 2ml/min 的流速來(lái)沖洗，要回復(fù)原來(lái)的溶劑體系，不需要每一步都沖洗，可以跳過(guò)中間步驟。中間步驟推薦使用異丙醇，然后用沒(méi)有緩沖的流動(dòng)相，zui后回復(fù)起始流動(dòng)相配置。四氫呋喃是另外一種比較受歡迎的去除污染的溶劑。如果使用者懷疑柱子被嚴(yán)重污染，可以二甲基亞砜（ DMSO ）或者二甲基甲酰銨和水按 50 ： 50 的比例混合用低于 0.5ml/min 的流速流過(guò)色譜柱。成功再生反相柱子是一個(gè)非常耗時(shí)間的過(guò)程，溶劑沖洗可以利用梯度系統(tǒng)過(guò)夜操作。
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